[Development of PCR methods for detection of EAV infection].

Abstract: The goal of this work was the development of suitable (real-time) RT-PCR techniques for fast and sensitive diagnosis of EAV and for molecular-epidemiological characterisation of viral strains, as an alternative to virus isolation. To this purpose two conventional RT-PCR methods and one real-time RT-PCR were adapted to detect the broadest possible spectrum of viral strains. Several dilutions with Bucyrus strain showed a 100-fold higher sensitivity of real-time RT-PCR and heminested RT-PCR compared to simple RT-PCR. Making use of 11 cell culture supernatants of different EAV isolates and 7 semen samples of positive stallions, the suitability of the techniques could be shown. Phylogenetic analysis of sequences of the newly analysed samples compared with known sequences indicated that more EAV-lineages exist than presently described. Ziel dieser Arbeit war, als Alternative zur Isolation geeignete (real-time) RT-PCR Methoden für die schnelle Diagnose von EAV und zur molekular-epidemiologischen Charakterisierung von Virusstämmen zu entwickeln. Hierfür wurden zwei konventionelle RT-PCR Methoden und eine real-time RT-PCR so adaptiert, dass ein möglichst breites Spektrum von Isolaten nachweisbar sein sollte. Verdünnungsreihen mit dem Bucyrus-Stamm zeigten eine hundertfach höhere Sensitivität der real-time- und der heminested RT-PCR im Vergleich zu der einfachen RT-PCR. Die Eignung der Methoden konnte mittels 11 Zellkulturüberständen verschiedener EAV-Isolate und 7 EAV-positiven Spermaproben gezeigt werden. Die phylogenetische Analyse der Sequenzen der eigenen Proben mit bekannten Sequenzen ergab Hinweise auf mehr EAV-Subgruppen als bisher beschrieben. Le but de ce travail était de développer, comme alternative à l'isolation, une méthode de RT-PCR (en temps réel) pour le diagnostic rapide de l'EAV et pour la caractérisation des souches virales. Pour cela, on a adapté deux méthodes de RT-PCR conventionnelles et une de RT-PCR en temps réel, de manière à ce qu'un spectre aussi large que possible d'isolats soit démontrable. Les lignées de dilution avec la souche Bucyrus ont montré une sensibilité cent fois plus élevée avec la RT-PCR en temps réel et avec la RT-PCR heminested qu'avec la RT-PCR simple. L'efficacité des méthodes a pu être démontrée avec 11 surnageants de cultures cellulaires de divers isolats d'EAV et 7 échantillons de sperme positifs à l'EAV. L'analyse phylogénétique des séquences des échantillons par rapport à des séquences connues laisse penser qu'il existe plus de sous-groupes d'EAV que décrit jusqu'à ce jour. Lo scopo di questo studio era di sviluppare un'alternativa ai metodi (real-time) RT-PCR adeguati all'isolamento, per la diagnosi rapida di EAV e per la caratterizzazione epidemiologica molecolare dei ceppi virali. A questo scopo, due metodi convenzionali di RT-PCR e uno di real-time RT-PCR sono stati adattati in modo che la più ampia gamma di isolati venisse rilevata. La serie di diluizioni con il ceppo Bucyrus ha segnalato una sensibilità cento volte maggiore con metodica real-time e heminested RT-PCR rispetto alla semplice RT-PCR. L'adeguatezza del metodo è stata dimostrata da 11 cellule di coltura surnatanti di diversi isolati EAV e 7 campioni di sperma EAV positivi. L'analisi filogenetica delle sequenze dei campioni propri con sequenze note ha rivelato evidenze di più sottogruppi EAV, come precedentemente descritto.